Neurotransmitterdetektion in vivo

Von Vera Rech, Ramona Draxler, Volker Bucher, Hochschule Furtwangen, sowie Boris Hofmann, Universität Tübingen

Bei Reaktionen von Neurotransmittern spielen Oxidations- und Reduktionsvorgänge eine wichtige Rolle. Die hierbei übertragenen Elektronen sind Basis für die Nervensignale. Zur Erfassung der Reaktionen, der wichtigen Konzentrationen sowie der Störeinflüsse eignen sich die elektrochemischen Analysenformen mit variierenden Strömen und Spannungen. Dafür steht eine ganze Reihe an unterschiedlichen Strom- und Spannungsverläufen zur Auswahl. Des Weiteren lassen sich durch die Gestaltung der Elektrodenoberflächen elektrochemische Reaktionen verändern beziehungsweise vollständig hemmen oder katalysieren. Dafür kommen Beschichtungen von Elektroden mit organischen oder anorganischen Verbindungen in Betracht, aber auch ionische Flüssigkeiten als relevanter Reaktionsbereich. Je nach Art der vorliegenden Neurotransmitter liegen die elektrochemischen Signale von Folgeprodukten einer elektrochemischen Reaktion sehr nahe beieinander. In einzelnen Fällen eignen sich Modifikationen der Elektrodenoberflächen oder auch der Strom-Spannungs-Kennwerte zur Trennung von sich überlagernden Signalen, sodass auch diese Reaktionen qualitativ oder quantitativ getrennt werden können.

-Fortsetzung aus WOMag 03/2016-

In-Vivo Neurotransmitter Detection Using Electrochemical Measurement TechniquesPart 3

Redox processes play a critical part in the reaction mechanisms of neurotransmitters. The electrons transferred in this way form the basis of nerve signals. To elucidate these mechanisms and the critical concentrations as well as interfering effects, electroanalytical techniques based on variation of current or voltage are ideal. A wide range of such techniques are available. An additional variable involves modification of the electrode surfaces used, which can allow either complete blocking of a reaction or its electrocatalysis. Such modifications are often based on coating the electrodes used with either organic or inorganic compounds. Ionic liquids can also be used. Depending on the type of neurotransmitter being studied, the electrochemical responses of reaction products can closely resemble that of the initial electrochemical reaction itself. In certain cases, the electrode coating compounds used and/or the electrochemical current-potential parameters must be modified in order to resolve otherwise overlapping electrochemical responses, either on a qualitative or a quantitative basis.

3.1.3 Differentielle Puls-Voltammetrie

Die Differentielle Pulsvoltammetrie (DPV) verwendet Potentialimpulse, die über ein linear ansteigendes Potential gelegt werden. Während jedes Impulses wird der Wert des angelegten Potentials konstant gehalten (Abb. 14). Jeweils vor dem Potentialimpuls und an dessen Ende werden die hervorgerufenen Flüsse gemessen. Beide Werte werden anschließend subtrahiert und jeweils das Ergebnis in einem Voltammogramm aufgetragen, sodass nur die Konzentrationsänderungen berücksichtigt werden. Die erhaltenen Voltammogramme besitzen ebenfalls die charakteristischen Oxidations-Peaks [8], diese sind aber deutlich spitzer als bei der reinen zyklischen Voltammetrie (CV). So können Stoffe, die bei angrenzenden Potentialen elektrolysieren einfacher unterschieden werden, da sich die Peaks nicht mehr überschneiden. Vor allem Störungen durch Ascorbinsäure werden hiermit vermieden [14, 19].

Die DPV ist eine beliebte Puls-Technik, da sie sehr sensitiv und selektiv ist und eine hoch aufgelöste Signalantwort liefert [20]. Diese­ Eigenschaften beruht auf der Tatsache, dass die störenden kapazitiven Flüsse, die beim Laden und Entladen der elektrischen Doppelschicht an der Elektrodenoberfläche entstehen, bei dieser Technik minimal sind. Die beiden in die Subtraktion ein­fließenden Werte werden erst dann gemessen, wenn die kapazitiven Störungen bereits abgeklungen sind; es werden also die ersten Millisekunden eines jeden Pulses ausgeblendet.

Diese nicht berücksichtigten Zeiträume von wenigen Millisekunden führen allerdings zu einer schlechten zeitlichen Auflösung, da die Messungen mehrere Sekunden in Anspruch nehmen. Die Ergebnisse stehen somit nur zeitlich versetzt zur Verfügung [8].

Derzeit werden insbesondere zwei DPV-Varianten angewandt: die Doppelpuls- und die Multipulsvariante. Bei den Doppelpulstechniken wird vor jedem Doppelpuls der ursprüngliche Gleichgewichtszustand wiederhergestellt (Abb. 14, a-c). Dies verhindert ungewollte Molekülansammlungen an der Elektrode. Die Erneuerung der ursprünglichen Bedingungen kann entweder durch das Öffnen des Stromkreises an der Arbeitselektrode erreicht werden oder durch das Anlegen eines geeigneten Anfangpotentials.

Die Doppelpulsvariante kann wiederum in drei Typen angewendet werden. Bei der Differentiellen Doppelpuls-Voltammetrie (DDPV) ist der zweite Puls t2 deutlich kürzer als der erste t1. Das Verhältnis liegt bei t1/t2 = 50 - 100 und bewirkt eine sehr hohe Sensitivität und Vereinfachung der mathematischen Verarbeitung (Abb. 14, a).

Sind beide Pulse etwa gleich lang, so wird von der Differentiellen Doppel-Normalpuls-Voltammetrie (DDNPV) gesprochen. Diese Technik verkompliziert das Problem durch die Erzeugung eines asymmetrischen Peaks (Abb. 14, b). Die Doppelpuls-Square-Wave-Voltammetrie (DPSWV) verwendet wiederum gleich lange Pulse, die Pulsänderung ist aber umgekehrt zur Scanrichtung (Abb. 14, c). Eine deutlich schnellere Lösung, ist die Multipulsvariante. Hier wird der ursprüngliche Gleichgewichtszustand nicht wiederhergestellt (Abb. 14, d-f). So wird zwar die zeitliche Auflösung verbessert, allerdings werden die elektroaktiven Moleküle nach und nach abgebaut und die Abbauprodukte sammeln sich an der Elektrodenoberfläche an. Dieser Effekt führt zu einer Beeinträchtigung der elektrochemischen Antwort der Elektrode. Zusätzlich kann die Multipulsvariante nur bei reversiblen Vorgängen angewendet werden, da das Superpositionsprinzip für quasireversible und irreversible Vorgänge nicht gilt.

Auch für die Multipulsvariante kommen drei Typen in Betracht. Die Differentielle Multipuls-Voltammetrie (DMPV) entspricht der DDPV mit dem Unterschied, dass der Gleichgewichtszustand nicht wiederhergestellt wird. Die Länge des Pulses tP ist deutlich kürzer, als die Zeit zwischen zwei Pulsen t1. Auch hier gilt ein Verhältnis t1/tP = 50 – 100 (Abb. 14, d). Die Differentielle Normal-Multipuls-Voltammetrie (DNMPV) ähnelt der DMPV, aber mit t1 ≈ t2 (Abb. 14, e); die Square-Wave-Voltammetry (SWV) ist eine bestimmte Form der DNMPV mit t1 = t2 und umgekehrten Richtungen von Pulsänderung und Scanrichtung (Abb. 14, f) [20].

Dopaminerfassung mit DPV

Für die Bestimmung von Dopamin mittels DPV können zum Beispiel folgende Elektroden eingesetzt werden:

• Multi-Wall-Carbon-Nanotubes-Pasten-
  Elektrode, beschichtet mit Eisen(II) Phthalocyanin (FePc MWCNTPEs) [16]
• Multi-Wall-Carbon-Nanotubes-Glas­elektrode beschichtet mit einem Nafion/Ni(OH)2-Gemisch [4]
• Single-Wall-Carbon-Nanotubes (SWCNT) modifiziert mit einer Glaskohlenstoff-Elektrode (GCE) [5]

Die Multi-Wall-Carbon-Nano-Tube-Pasten-Elektrode, beschichtet mit Eisen(II)Phthalocyanin (FePc MWCNTPEs), eignet sich für die zyklische Voltammetrie und die differentielle Pulsvoltammetrie, wie dies bereits über den Einsatz zur Bestimmung von ­Dopamin beschrieben wurde [16].

Mit der Multiwalled-Nano-Tube-modifizierten Glaskohlenstoffelektrode, die mit Nafion/Ni(OH)2 beschichtet ist (MWNTs/GCE (Nafion/Ni(OH)2)), können die Anodenspitzenwerte von Dopamin und Ascorbinsäure mithilfe der differentiellen Pulsvoltammetrie getrennt werden. Bei Potentialänderungen zwischen -100 mV und 600 mV lassen sich Anodenspitzenwerte für Dopamin bei 150 mV feststellen. Außerdem besteht eine lineare Proportionalität zwischen dem Anodenspitzenfluss von Dopamin und der Dopaminkonzentration in einem Bereich von 0,05 µmol/l bis 10 µmol/l. Die Erfassungsgrenze dieser Elektrode liegt bei der differentiellen Pulsvoltammetrie bei 0,015 µmol/l [4].

Mit der Glaskohlenstoffelektrode mit Single-Wall-Karbon-Nanotubes (SWCNT) kann Dopamin erfasst werden. Dabei wird bei 200 mV das Spitzenoxidationspotential sichtbar, während bei Verwendung einer Glaskohlenstoffelektrode ohne Beschichtung das Spitzenpotential bei 223 mV liegt. Abbildung 15 zeigt, dass die Lokalisation des Spitzenpotentials von der verwendeten Elektrode abhängt.

Ein wichtiger Punkt bei den Messungen ist der pH-Wert. Es besteht ein linearer Zusammenhang zwischen dem pH-Wert und dem Oxidationsstrom. Jedoch können nur bei pH-Werten zwischen 3,35 und 8,83 eindeutige Oxidationsspitzen erfasst werden. Bei pH-Werten über 9,0 sind keine Spitzenwerte mehr erkennbar. Ein weiterer wichtiger Zusammenhang wird zwischen dem Spitzenfluss und der Quadratwurzel der Abtastrate deutlich. Denn bei Abtastraten von 20 mV/s bis 150 mV/s besteht ein linearer Zusammenhang zwischen beiden Größen.

Der nächste lineare Zusammenhang existiert zwischen dem Spitzenfluss und der Pulsamplitude in einem Bereich von 10 mV bis 200 mV. Eine Veränderung der Puls­periode und der Pulsweite hat keinen Einfluss auf den Spitzenfluss. Dieser bleibt bei einer Variation der beiden Parameter konstant. Ein weiterer linearer Zusammenhang besteht zwischen dem Spitzenfluss und der Konzentration an Dopamin im Bereich von 0,5 µmol/l bis 100 µmol/l. Mit dieser Elektrode liegt die Erfassungsgrenze von Dopamin bei 7,0 µmol/l bei einer Sensitivität von 77,9 nA µl/mol.

Wie bei allen anderen Elektroden müssen­ auch hier die Störsubstanzen beachtet werden, die in biologischen Flüssigkeiten stets in Form von elektrochemisch aktiven Komponenten, wie Inosin, Hypoxanthin, Xanthin, Harnsäure und Ascorbinsäure, enthalten sind. Dabei sollten die verschiedenen Effekte, die diese Substanzen auf den Spitzenfluss ausüben, genauer untersucht werden. In der Gegenwart von Hypoxanthin wird ein zusätzlicher Spitzenwert bei 1003 mV sichtbar. Der Spitzenwert von Dopamin wird somit nicht beeinflusst, solange Hypoxanthin in einer achtmal geringeren Konzentration im Vergleich zu Dopamin vorhanden ist. Bei höheren Konzentrationen wird der Dopaminspitzenfluss beeinträchtigt. Ascorbinsäure hat keinen Einfluss auf den Dopaminspitzenfluss. Xanthin zeigt einen klaren Spitzenfluss bei 680 mV. Dabei ist ein Dopaminabfall von etwa 25 % zu erkennen. In der Gegenwart von Inosin wird der Spitzenfluss von Dopamin nicht beeinflusst, ebenso bis zu einem 50-fachen Überschuss an Harnsäure.

Mit dieser Elektrode wurden nahezu identische Flussintensitäten an sieben aufeinanderfolgenden Tagen aufgezeichnet. Die Flussintensitäten liegen hierbei noch bei 95 % bis 98 % seiner ursprünglichen Fluss­intensität. Es entstehen durch das mehrfache Verwenden also nur sehr geringe Fehler. Nach diesen sieben Tagen ist ein ­beträchtlicher Rückgang erkennbar, weshalb von einem längeren Gebrauch der Elektrode abgeraten wird [5].

Serotoninerfassung mit DPV

Für die Bestimmung des Serotoningehalts­ eignet sich zum Beispiel eine Multi-Wall-Carbon-Nanotubes-Glaskohlenstoffelektrode,beschichtet mit einem Nafion/Ni(OH)2-Gemisch [4].

Mit der Elektrode können die Anoden­spitzenwerte von Serotonin und Ascorbinsäure unter Verwendung der differentiellen Pulsvoltammetrie separiert werden. Bei Potentialveränderungen zwischen -100 mV und 600 mV können Anodenspitzenwerte­ für Serotonin bei 350 mV aufgezeichnet werden. Außerdem besteht eine lineare Proportionalität der Serotoninkonzentration in einem Bereich von 0,008 µmol/l bis 10 µmol/l bei einer Erfassungsgrenze von 0,003 µmol/l [4].

Adenosinerfassung mit DPV

Adenosin kann zum Beispiel mit einer Glaskohlenstoffelektrode (GCE) mit Single-Wall-Karbon-Nanotubes (SWCNT) erfasst werden [5]. Für dieses System liegt bei 1239 mV ein verbreitertes Spitzenoxidationspoten­tial vor. Das Potential ist vom pH-Wert abhängig, da Protonen an Elektrodenoberflächenreaktionen beteiligt sind. Es ist ein linearer Anstieg des Spitzenpotentials bei einem pH-Wert im Bereich von 3,35 bis 10,89 zu erkennen.

Ein weiterer linearer Zusammenhang besteht zwischen dem Spitzenfluss und der Abtastfrequenz in einem Bereich von 10 mV/s bis 125 mV/s. Bei Abtastfrequenzen über 125 mV/s bleibt der Strom kon­stant. Dieses Verhalten weist auf Adsorptionsprobleme bei Adenosin hin. Ein Grund dafür ist das elektrochemische Verhalten dieses Neurotransmitters. Ein linearer Zusammenhang ist zwischen dem Spitzenfluss und der Pulsamplitude in einem Bereich von 10 mV bis 150 mV festzustellen. Eine Veränderung der Pulsperiode und der Pulsweite hat keinen Einfluss auf den Spitzen­fluss. Dieser bleibt bei Variation der beiden Parameter konstant. Schließlich zeigen der Spitzenfluss und die Konzentration des Adenosins einen linearen Zusammenhang: Je höher die Konzentration ist, desto höher ist der Spitzenfluss.

Mit dieser Elektrode liegt die Erfassungsgrenze von Serotonin bei 34,7 µmol/l bei einer Sensitivität von 9,5 nA µmol/l, wobei der Einfluss von Störsubstanzen zu berücksichtigen ist. In der Gegenwart von Hypoxanthin wird ein zusätzlicher Spitzenwert bei 1003 mV sichtbar. Der Spitzenwert von Adenosin wird dabei nicht beeinflusst, solange das Verhältnis von Adenosinkonzentration zu Hypoxanthinkonzentration nicht höher als 1:8 ist. Bei höheren Verhältnissen überlagern sich die Spitzenwerte der beiden Substanzen. Die Ascorbinsäure weist keinen Einfluss auf den Spitzenfluss auf. Xanthin zeigt einen klaren Spitzenfluss bei 680 mV, wodurch der Spitzenwert von Adenosin nicht beeinflusst wird. In der Gegenwart von Inosin wird der Spitzenfluss von Serotonin leicht beeinflusst. Dieser zeigt ­einen leichten Anstieg bei hohen Inosinkonzentrationen. Die Harnsäure beeinflusst den Spitzenfluss von Adenosin bis zu einem 50-fachen Überschuss an Harnsäure nicht.

Mit dieser Elektrode können nahezu identische Flussintensitäten an sieben aufeinanderfolgenden Tagen aufgezeichnet werden. Die Flussintensitäten liegen dabei noch bei 95 % bis 98 % seiner ursprünglichen Flussintensität. Es entstehen durch den Gebrauch also nur sehr geringe Fehler. Nach diesen sieben Tagen ist ein beträchtlicher Rückgang erkennbar [5].

Gleichzeitige Erfassung
verschiedener Neurotransmitter mit DPV

Eine mit Nafion/Ni(OH)2 beschichtete und mit Multiwalled-Nano-Tube-modifizierte­ Glaskohlenstoffelektrode (MWNTs/GCE (Nafion/Ni(OH)2)) eignet sich zur Erfassung von Anodenspitzenwerten von Dopamin, Serotonin und Ascorbinsäure mittels differentieller Pulsvoltammetrie. Der Spitzenwert des Dopamins liegt bei 150 mV, der des Serotonins bei 350 mV und der der Ascorbinsäure bei 10 mV. Abbildung 16 zeigt das Voltammogramm mit den klar getrennt liegenden Signalen [4].

Mit der Single-Wall-Karbon-Nanotube-Glaskohlenstoffelektrode kann Dopamin und Adenosin einzeln sowie gleichzeitig erfasst werden, da das Spitzenpotential für Dopamin bei 156 mV und ein verbreitertes Spitzenoxidationspotential für Adenosin bei 1239 mV liegt. Diese Elektrode und Technik gilt deshalb auch als exakte und rentable Technik für diese beiden Neurotransmitter [5].

3.1.4 Analysen mittels
Square Wave Voltammetry (SWV)

Adrenalinerfassung mit SWV

Die Erfassung von Adrenalin kann mit einer biologischen Elektrode erfolgen, die mit der ionischen Flüssigkeit 1-Butyl-3-Methyl­imidazolium Hexafluorophosphat (BMIPF6) und Nujol als Bindemittel beschichtet ist [9]. (Die Elektrode ist im Abschnitt über zyklische Voltammetrie näher beschrieben.) Für die Square-Wave-Voltammetrie wurde eine Beschichtung aus 50 % Nujol und 50 % BMIPF6 gewählt. Das Potential wurde zwischen 200 mV und -600 mV bei einer Frequenz von 10 Hz bis 100 Hz, einer Pulsamplitude von 10 mV bis 100 mV und einer Scanrate von 5,0 mV/s verändert. Bei diesen Einstellungen wird das beste Ergebnis für eine Frequenz von 80 Hz, eine Pulsamplitude von 60 mV und einen pH-Wert von 7 erzielt [9]. Das o-Chinon wird bei einem Potential von -230 mV elektrochemisch zu ­Adrenalin reduziert, was in Abbildung 17 bei -230 mV zu sehen ist.

3.1.5 Analyse mittels
Paired-Pulse Voltammetry (PPV)

Mit der Paired-Pulse-Voltammetry werden Adsorptionseigenschaften für die Analyse herangezogen. Zudem werden zum Beispiel Auswirkungen von pH-Wert-Änderungen auf die Messergebnisse stark reduziert [21].

Bei PPV handelt es sich um eine Abwandlung von FSCV. Der Unterschied besteht darin, dass bei PPV zwei identische Pulse in einem bestimmten zeitlichen Abstand gesendet werden. In der Zeit zwischen den Pulsen wird, wie bei FSCV, ein konstantes, negatives Haltepotential aufrechterhalten [18]. Zur Dopaminmessung wird beispielsweise eine Wiederholungsrate von 1 Hz verwendet, mit Abständen zwischen den Pulsen von 2 ms bis 80 ms und einem Haltepotential von -0,4 V [21]. Die Zeit zwischen dem ersten Puls der aktuellen Messung und dem zweiten Puls der vorherigen Messung wird als effektive Wiederholungszeit des ersten Pulses bezeichnet und die Zeit zwischen dem ersten und zweiten aktuellen Puls mit effektive Wiederholungszeit des zweiten Pulses (Abb. 18). Aus den Unterschieden der effektiven Wiederholungszeiten ergibt sich die Menge an adsorbiertem Stoff an der Mikroelektrodenoberfläche [18]. Anhand seiner Adsorptionseigenschaften kann wiederum der detektierte Stoff bestimmt werden [8]. Durch Variation der Zeit zwischen zwei Scans kann auf die Stärke des Reduktionsprozesses während der Scans beziehungsweise während des Halte­potentials geschlossen werden [21].

Bei beiden Pulsen werden die entstehenden Ströme aufgezeichnet und in zwei deutlich unterschiedlichen Voltammogrammen aufgetragen: das P-Voltammogramm des ersten Pulses und das S-Voltammogramm des zweiten Pulses. Die Differenz dieser Messwerte bildet das P-S-Voltammogramm. Alle drei Messreihen werden außerdem mit ihren Background-Voltammogrammen verrechnet, um die Adsorption während der Messung zu veranschaulichen (Abb. 19) [18].

Das P-S-Voltammogramm lässt sich verstärken, indem Parameter verändert werden, die zum Beispiel den Dopamin-Chinon-Reduktionsprozess unterstützen; dies ist beispielsweise bei Erhöhung des Umkehrpotentials von +0,1 V auf +1,5 V der Fall (Abb. 20). Die Reaktion am zweiten Puls wird hiermit verringert, wodurch ein größerer Ausschlag am P-S-Voltammogramm auftritt (Abb. 20, B).

Im P-S-Voltammogramm sind im Vergleich zu anderen Messmethoden bestimmte Effekte, wie zum Beispiel pH-Wert-Änderungen und schwankende Effekte an der Elektrodenober­fläche, deutlich verringert, da diese sowohl im P-als auch im S-Voltammogramm auftreten und sich infolgedessen gegenseitig aufheben [21].

Bei Vergrößerung der Werte für die effektive Wiederholungszeit des zweiten Pulses­ steigt auch der gemessene Fluss an der Elektrode bis zu einem Plateau an. Bei Verringerung der effektiven Wiederholungszeit des zweiten Pulses treten Verzerrungen des zweiten Pulses auf. Experimente zeigen, dass daher eine Mindestwartezeit von 2 ms zwischen zwei Pulsen benötigt wird, um die Verzerrungen im S-Voltammo­gramm zu vermeiden [18]. Zur Analyt­bestimmung bietet sich folglich eine Wartezeit größer 2 ms an, die aber gleichzeitig deutlich kleiner ist als die Zeit, ab der ein Plateau erkennbar ist (Abb. 21).

Zur Unterscheidung der nachgewiesenen Stoffe kann neben den Adsorptionseigenschaften auch die Reaktionszeit der Stoffe genutzt werden. Diese wird unter anderem durch Molekülgröße, -masse, -ladung oder Redoxprozesse beeinflusst. Experimentell wurde ermittelt, dass die Reaktionszeit von Dopamin nur halb so lange ist wie die von Adenosin. Dies ist vermutlich auf den geringeren Diffusionskoeffizienten bei Adenosin zurückzuführen [18].

Bei vielen Neurotransmittern (z. B. Dopamin) findet während der PPV eine Verschmutzung der Elektrode statt. Um dies zu verhindern, kann vor der PPV-Messung für einige Minuten FSCV mit einem Umkehrpotential von +1,5 V durchgeführt werden, wodurch die Elektrodenoberfläche gesäubert wird [21].

3.2 Amperometrie

Die amperometrischen Techniken sind aufgrund ihrer hohen Sensitivität, ihrer preisgünstigen Verwendung und Herstellung ­sowie ihren guten zeitlichen Auflösungen sehr interessant [22]. Beispielsweise dauert eine amperometrische Messung weniger als eine Millisekunde, eine voltammetrische dagegen zwischen 20 Sekunden und 100 Sekunden. Amperometrische Techniken werden schon bei der Aufzeichnung von Katecholamin- und Indol-Stoffwechselprodukten ver­wendet.

Die Fast-Scan-Cyclic-Voltammetry und Differential-Puls-Amperometry wurden eingesetzt, um Monoaminfreisetzungen zu messen, die durch kurze elektrische Stimulation der afferenten Axone freigesetzt werden. Mithilfe der amperometrischen Techniken verbesserte sich die Erfassungsgrenze von Katecholaminen auf 5 nmol/l [23].

3.2.1 Constant Potential Amperometry (CPA)

Die Fixed Potential Amperometry (FPA) [6], die auch als Constant Potential Amperometry (CPA) [8] bezeichnet wird, ist eine der einfachsten amperometrischen Techniken zur Erfassung der relativen Konzentrationsänderungen an Neurotransmitter. Damit können Wiederaufnahme- und Abgabeprozesse genauer untersucht werden. Bei dieser Technik werden kontinuierliche Flüsse in der Elektrode bei einer konstanten Oxidationsspannung an der Arbeits­elektrode gemessen [6]. Die Spannung wird dabei so gewählt, dass sie ausreicht, um den jeweiligen Neurotransmitter zu oxidieren oder zu reduzieren [8]. Möglich werden damit Messungen im Bereich einer Millisekunde und kürzer [6], sodass mehr als 10 000 Probenaufzeichnungen pro Sekunde und zugleich eine bessere zeitliche Auflösung als bei den voltammetrischen Techniken realisierbar wird. Ein weiterer Vorteil sind die sehr geringen Hintergrundflüsse an der Elektrodenoberfläche [24].

Nachteilig ist dagegen, dass alle elektrochemischen Komponenten, die bei der angelegten Spannung oxidieren oder reduzieren, also eine faradaysche Reaktion an der Elektrode auslösen, damit zum resultierenden Fluss an der Elektrode beitragen [6]. Zwar sind die Reaktionen linear proportional zur Konzentration der elektroaktiven Moleküle [24], allerdings ist nicht erkennbar, welche Substanzen oxidiert beziehungsweise reduziert wurden [6]. Dies führt zu einer schlechten Selektivität der Methode im Vergleich zu den voltammetrischen Techniken [13], weshalb die Technik oft in Kombination mit der elektrischen Deep-Brain-Stimulation oder einer chemischen Stimulation benutzt wird [25]. Dabei wird versucht, bestimmte neuronale Wege so zu stimulieren, dass die Konzentration des gewünschten Neurotransmitters ansteigt. Somit kann mit einer höheren Wahrscheinlichkeit eine Aussage über den erfassten Neurotransmitter gemacht werden, da die Flussstärke proportional zur Anzahl der reagierenden Moleküle pro Zeiteinheit ist [8]. Dies erlaubt eine Konzentrationsbestimmung der Analysenlösung [13].

Die Wiederaufnahme eines Neurotransmitters wie zum Beispiel Dopamin erfolgt nach der Michaelis-Menten-Theorie und ist nur dann genau, wenn die Freisetzungsmenge an Dopamin wesentlich kleiner ist als die Michaelis-Menten-Konstante Km und das elektrochemische Signal nicht durch die Diffusion von Dopamin an die Elektroden­oberfläche beeinflusst wird. Mit der Michaelis-Menten-Theorie ist es möglich, eine quantitative Beschreibung der anfänglichen Reaktionsgeschwindigkeit in Abhängigkeit von der vorhandenen Substratkonzentration und weiteren Parametern zu machen. Es ist ein mathematisches Modell, das die Geschwindigkeit einer enzymatischen Katalyse beziehungsweise einer biochemischen Reaktion beschreibt [26].

Ein weiteres Problem der CPA, das auch bei den voltammetrischen Techniken auftritt, ist die Ablagerung von Substanzen auf der Elektrodenoberfläche. Diese filmartigen Ablagerungen durch entstehende Phenoxy-­Radikale führen durch weitere ­Reaktionen zu aminochromen Strukturen und zu einer Passivierung der Elektrode [8]. Zu beobachten ist dies häufig bei Metallelektroden wie Platin und Gold, mit denen Kohlenhydrate, Aminosäuren, Bioamine und Thiole erfasst werden. Derartige Filme verändern die Ergebnisse bei zeitlich länger dauernden Messungen [22].

Unter Verwendung von Biosensoren kann Dopamin erfasst werden. Voraussetzung ist eine konstante Spannung, bei der Dopamin oxidiert wird. Je nach Elektrode liegt diese Spannung bei unterschiedlichen Werten: für einen Biosensor zum Beispiel um 800 mV [24, 6] oder für eine unbehandelte­ Karbonfaserelektrode um 400 mV [25]. Ein Vorteil der Fixed-Potential-Amperometry-­Methode ist, dass durch eine Enzyme-Linked-Elektrode auch Moleküle detektiert werden können, die nicht elektrochemisch aktiv sind, wie zum Beispiel Glutamat und Adenosin. Möglich ist dies durch Wechselwirkung des elektrochemisch inaktiven Liganden zu einem Reportermolekül, wie zum Beispiel Wasserstoffperoxid. Hierbei geben die Reportermoleküle Elektronen an eine Messelektrode ab, an der dann faradaysche Flüsse entstehen, die proportional zur Analytkonzentration sind. Um Dopamin zu erfassen, sollte die angelegte Spannung bei 600 mV und für Adenosin bei 500 mV liegen [6, 24].

Dopaminerfassung mit CPA

Bei der Erfassung von Dopamin wird eine Arbeitselektrode und eine Referenzelek­trode oder Hilfselektrode benötigt. Die ­Referenzelektrode wird nahe an der Arbeitselektrode platziert. Sie besteht meist aus einem mit Silberchlorid beschichteten Silberdraht, im Falle von Messungen in biologischen Systemen mit einem Durchmesser im Mikrometerbereich. Die Arbeitselektrode ist meist eine Karbonfaserelektrode, da diese kleine Dimensionen hat und sehr schnell auf Veränderungen des Neurotransmitters Dopamin reagieren kann [26]. Die kurzen Reaktionszeiten erlauben eine hohe zeitliche Auflösung. Dadurch können die Freisetzung, die Wiederaufnahme und die Autoregulation von Dopamin beobachtet werden, die mit hohen Geschwindigkeiten ablaufen [25]. Je nach angelegter Spannung an der Arbeitselektrode wird Dopamin oxidiert oder Dopaquinon, die oxidierte Form des Dopamins, reduziert [8].

Unter Verwendung einer kugelartigen Mikro­elektrode sinkt der gemessene Fluss in einer gewissen Zeit bis auf einen Grenzwert. Dieser Grenzwert ist proportional zu der Dopaminkonzentration. Je geringer der Radius der Mikroelektrode ist, desto schneller wird der Grenzwert (Steady-State-Bedingung) erreicht [26]. Aufgrund der permanenten Oxidation von Dopamin entsteht ein Diffusionsgrad in das um die Elektrode liegende Gebiet. Die Dicke der dabei entstehenden Diffusionsschicht um die Mikroelektrode erhöht sich mit einem gewissen Faktor, wenn Spannung und Konzentration der zu messenden Substanzen konstant bleiben. Die statische Diffusionsschicht hängt von der Konzentration des extrazellulären Dopamins, den weiteren oxidierfähigen Substanzen bei der angelegten Spannung und den Elektrodendimensionen ab. Je größer die statische Diffusionsschicht ist, desto geringere Flüsse werden gemessen. Die dynamische Diffu­sionsschicht bildet sich über der statischen aus. Diese kann bei Dopamin eine Dicke von bis zu 50 µm erreichen [26].

Soll die Dopaminbestimmung mithilfe der Deep-Brain-Stimulation kombiniert werden, wird eine bipolare Stimulationselektrode in die dopaminergen Axone im Medialen Forebrain Bundle platziert. Durch die Deep-Brain-Stimulation des Medialen Forebrain Bundles kann ein schneller Anstieg des striatalen Dopamins erfolgen. Dieser führt dann zu einem Anstieg der gemessenen Flussstärken. Durch Beendigung der Stimulation fällt die gemessene Flussstärke schnell wieder auf das ursprüngliche extrazelluläre Dopaminniveau zurück [24]. Dabei hat die Stimulationsfrequenz keinen Einfluss auf die Michaelis-Menten-Konstante Km und auf die maximale Enzymreaktionsgeschwindigkeit Vmax.

Zusätzlich muss eine systemische Regulierung beachtet werden. Das Nomifensin spielt eine besondere Rolle. Es hat eine anti­depressive Wirkung [26]. Für Tests kann dieser Stoff extern zugegeben werden und führt dann zu einer Dopamin-Wiederaufnahmehemmung [24] sowie zu eindeutigen Veränderungen aller kinetischen Parameter. Zudem hat die Stimulationsfrequenz Einfluss auf die maximale Dopaminkonzentration [26]. Durch eine mediale Forebrain-Stimulation und das damit freigesetzte Dopamin verzögert sich also der Rückgang auf das Grundniveau [24]. Im Folgenden werden verschiedene Parametereinstellungen und Elektrodenplatzierungen zur Dopamin­erfassung dargestellt.

So kann mit monopolaren Pulsen bei 60 Hz stimuliert werden. Dabei sollte zwischen den einzelnen Pulsen eine stimulationsfreie Phase von 5 s liegen. Eine Karbonfaserelektrode wird im dorsomedialen Striatum positioniert und so eingestellt, dass ein stabiles, durch Stimulation erzeugtes Signal gemessen werden kann. Die Referenzelektrode wird in das oberflächliche Kortikalgewebe kontralateral zur Karbon­faserelektrode und zur Stimulationselek­trode platziert [24].

Bei Verwendung von biopolaren Elektroden, die parallel mit einem Abstand von 0,5 mm ausgerichtet sind sowie jeweils eine Dicke von 0,1 mm und eine Länge von 0,25 mm haben, kann eine elektrische Stimulation aus Rechteckwellenpulsen mit 200–300 µA und einer Dauer von jeweils 0,3 ms aufgebracht werden. Die durch die Stimulation verursachte Dopaminerhöhung im Gehirn wird entweder als Konzentra­tionsänderung oder als Oxidationsflussveränderung angegeben. Eine Kohlenstoff­elektrode wird in die mesolimbischen Bahnen, die als dopaminerge Projektionen der Area Tementalis verntralis bezeichnet werden, implantiert. Dazu zählen unter anderem der Nucleus Caudatus im Striatum, der Nucleus Accumbens, der Bulbus Olfactorius und der ventromediale präfrontale Cortex. An dieser Elektrode wird der Fluss gemessen. Weiterhin sollte beachtet werden, dass die extrazelluläre Dopaminmessung durch die Gegenwart von Ascorbinsäure und DOPAC beeinflusst wird. Bei diesen Substanzen liegen die Oxidations­potentiale bei nahezu der gleichen Spannung. Diese können durch das Verwenden einer behandelten Elektrode oder durch Hinzufügen von Paragylin separiert werden. Das Paragylin hemmt die Entstehung von DOPAC-Störungen [25].

Abbildung 22 zeigt die Diagramme bei unterschiedlichen Stimulationsfrequenzen von 20 Hz (A) und 100 Hz (B) sowie vor einer Nomifensinbehandlung mit 20 mg/kg und danach. Demzufolge werden bei höheren Stimulationsfrequenzen auch höhere Dopa­minkonzentrationen freigesetzt. Durch die Nomifensinbehandlung verändert sich die Signalamplitude. Zudem ist festzustellen, dass sich bei einer Nomifensinbehandlung der Rückgang vom Maximum zur Basis über eine längere Zeit ausdehnt, da die Wiederaufnahme des Dopamins von den Zellen ­gehemmt wird [26].

Eine weitere Untersuchung erfolgte durch Implantieren einer Arbeitselektrode in die Caudate Nucleus mit vertikal angeord­neter Elektrode, sodass maximale Konzentrationswerte während der Stimulation aufgezeichnet werden können. Die Stimulationselektrode wird wieder im medialen Forebrain Bundle implantiert, mit einem konstanten Fluss von 350 µA und einer Stimulationsfrequenz zwischen 10 Hz und 60 Hz belegt und einer Wartezeit zwischen den einzelnen Stimulationen von sieben Minuten eingehalten. Um eine Signalreinheit zu erhalten, wird das Signal gefiltert.

Während das Dopamin an der Elektrode oxidiert wird, kann das Dopaquinon in das umliegende Gewebe diffundieren und mit den benachbarten Zellen reagieren. Dort reagiert es zum Beispiel mit einem Ascorbat­anion, wodurch das bereits oxidierte Dopamin wieder reduziert wird. Dieses Dopamin kann im Anschluss wieder einen Fluss in der Elektrode auslösen und damit das Messergebnis verändern. Um dies zu verhindern, wird die Arbeitselek­trode zum Beispiel mit Nafion beschichtet. Durch diese Beschichtung werden die anionischen Substanzen der extrazellulären Flüssigkeiten abgehalten und können die Elektrodenoberfläche nicht erreichen. Die Beschichtung schützt die Elektrodenoberfläche vor Proteinanlagerungen, führt jedoch zu einem geringeren Diffusionskoeffizient des Dopamins in den Film und zu einer unerwünschten, langsameren Reaktions­geschwindigkeit an der Elektrode [27].

Glutamaterfassung mit CPA

Glutamat zählt, ebenso wie Adenosin, zu den elektrochemisch inaktiven Neurotransmittern. Der Aufbau einer beschichteten Elektrode für die Erfassung von Glutamat ist in Abbildung 23 dargestellt.

Ein konstantes Potential liegt an einem Platindraht (PT) an. Um Glutamat zu erfassen, ist der Platindraht mit Nafion und Glutamat-Oxidase (Glu-Ox) beschichtet. Das lokale Glutamat kommt mit der Gluta­mat-Oxidase in Verbindung. Diese wird mithilfe von Bovine Serum Albumin (BSA) und Glutaraldehyde (glut) an der Oberfläche fixiert. Das Glutamat reagiert mit der Glutamat-Oxidase zu α-Ketoglutarat (α-KG). Dadurch entsteht Wasserstoffperoxid (H2O2), das durch die Fixed-Potential-­Amperometrie an der Platinoberfläche oxidiert und als amperometrisches Signal erfasst wird [24]. Das Wasserstoffperoxid wird auch als Reportermolekül bezeichnet, das elektrochemisch aktiv ist und es ermöglicht, nicht elektrochemisch aktive Moleküle zu detektieren. Es zerfällt im Anschluss zu zwei Wasserstoffprotonen (H+) und Sauerstoff (O2) sowie zwei frei werdenden Elektronen, die für den elektrischen Fluss am Platindraht verantwortlich sind.

Das Nafion auf dem Biosensor dient auch zum Abblocken von anderen Molekülen [6]. Dazu gehören die enzymatischen Produkte des Glutamats, die ebenfalls während der Reaktion entstehen. Durch Verwendung eines zweiten Sensors wird hierurch die entstehende Signalverunreinigung verringert. Sein Aufbau entspricht dem der ersten Elektrode, allerdings ohne das Enzym Glutamat-Oxidase. Er zeichnet die Flüsse auf, die von den enzymatischen Produkten erzeugt werden. Durch den Vergleich beider Messwerte kann eine bessere Sensitivität erreicht werden [24].

Adenosinerfassung mit CPA

Für die Adenosinbestimmung wird eine Platinelektrode, die mit einem oder mehreren Enzymen beschichtet ist, verwendet. Außer­dem wird eine semipermeable Membran benötigt, die störende Substanzen von der Elektrodenoberfläche fernhält.

Wird eine mehrfachbeschichtete Enzymelektrode mit Adenosin-Desaminase, Nukleosid-Phosphorylase und Xanthin Oxidase verwendet, wandelt die Adenosin-Desaminase das Adenosin zunächst in Inosin um. Im Folgenden wird das Inosin mit Nukleo­sid-Phosphorylase zu Hypoxanthin und dieses mit Xanthin Oxidase zu Xanthin und Harnsäure umgewandelt. Gleichzeitig wird Wasserstoffperoxid frei, das am Sensor oxidiert und zu einem amperometrischen Signal führt.

Der beschriebene Biosensor reagiert nicht nur auf Adenosin, sondern auch auf dessen enzymatische Produkte Inosin, Xanthin und Hypoxanthin. Um eine Signalverunreinigung durch diese Stoffe zu vermeiden, kann wie bei der Glutamatbestimmung, zusätzlich eine zweite Elektrode verwendet werden. Ihr Aufbau entspricht dem der ersten Elektrode, allerdings ohne das Enzym Adenosin-Desaminase. Durch den Vergleich beider Messreihen wird eine bessere Selektivität erreicht [24].

Adrenalinerfassung mit CPA

Adrenalin kann mit einer Kohlenstoffpastenelektrode mit eingefügten Pflanzen­enzymen in Kombination mit einem Überträger erfasst werden. Die Verwendung einer solchen Elektrode ist kostengünstig. Sie hat eine gute Sensitivität für Adrenalin und ist einfach herzustellen. Da das Oberflächenmaterial leicht ausgetauscht werden kann, ist die Elektrode mehrfach verwendbar [9].

Gleichzeitige Erfassung
von verschiedenen Neurotransmittern

Mithilfe eines amperometrischen Silizium-Mikroflüssigkeitskanal-Enzymsensors und einer mit Silberchlorid beschichteten Silber­elektrode können Glucose, Glutamat und Glutamin gleichzeitig erfasst werden. Dafür wird ein Sensor benötigt, der mit Glucose-Oxidase, Glutamat-Oxidase und einem Zwei-Enzymsystem aus Glutaminase­ und Glutamat-Oxidase beschichtet ist.

Wie bei den zuvor genannten Neurotransmittern ist hier wieder das Wasserstoffperoxid das Überträgermolekül der enzymatischen Reaktion. Das Wasserstoffperoxid entsteht als Nebenprodukt bei Reaktionen der verschiedenen Substanzen mit der Enzymbeschichtung und wird von der Silberreferenzelektrode erfasst. Dabei finden am Glutamin-Biosensor folgende zwei enzymatische Reaktionen statt: Zunächst wird das Glutamin mit Gluataminase zu Glutamat und Ammonium (NH4+) umgewandelt. Während der zweiten enzymatischen Reaktion reagiert mithilfe von Glutamat-Oxidase das Glutamat zu a-Ketoglutarat, Ammonium und Wasserstoffperoxid (H2O2) weiter. Bei der gleichzeigen Erfassung dieser beiden Substanzen könnte durch die Umwandlung von Glutamin in Glutamat das Ergebnis der Glutamaterfassung verfälscht werden. ­Daher wird der Glutaminsensor nach dem Glutamatsensor und der Glucosesensor hinter dem Glutamat- und Glutaminsensor platziert.

Der Mikroflüssigkeitskanal ist mit einer ­Acrylglas/Plexiglas-Platte, die Löcher zum Einströmen und Ausfließen der Substanzen enthält, bedeckt. Außerdem enthält das System ein Fließinjektionsanalysesystem mit dem eine elektrochemische Charakte­risierung der einzelnen Substanzen sowie eine Analytbestimmung durchgeführt werden können. Durch die Anwendung eines Fließinjektionsanalysesystems können Parameter wie die Peakhöhe, -fläche oder -weite des faradayschen Flusses verändert werden.

Bei der Messung dieser Substanzen ist der Umgebungs-pH-Wert entscheidend. Der optimale pH-Wert für den Glucosesensor liegt bei 6, da er dann die höchste Sensitivität aufweist. Diese sinkt bei einem Anstieg auf pH 8 auf 80 % und bei pH 4 beziehungsweise pH 9 auf 20 %. Der optimale pH-Wert für Glutamat liegt bei pH 8 und sinkt für pH 6 auf 40 %. Ab einem pH-Wert von 5,5 ist das Sensorsignal nicht mehr auswertbar. Die höchste Sensitivität des Glutaminsensors liegt bei pH 5,5 bis pH 6. Die Erfassungsgrenze für den Glucose- und Glutamatsensor beträgt 0,05 mmol/l, für den Glutaminsensor 0,1 mmol/l. Die Sensitivität für den Glucosesensor ist 1,47 µAsl/mmol, für den Glutamatsensor 3,68 µAsl/mmol und für den Glutaminsensor 0,28 µAsl/mmol. Nach neun Tagen und einer Temperatur von 4 °C ist ein Rückgang der Enzymaktivität des Glutamatsensors um ungefähr 40 % zu erkennen. Beim Glutamatsensor beträgt der Rückgang ungefähr 85 %.

Tabelle 3 enthält eine Zusammenstellung verschiedener Neurotransmitter und ihrer Enzymbeschichtungen für die Elektrode.

3.2.2 Chronoamperometrie (CA)

Die Chronoamperometrie ist eine Variation der Constant-Potential-Amperometrie. Hierbei wird die Spannung von einem Anfangswert, bei dem keine Redoxreaktion stattfindet, bis zu einem Endwert, bei dem eine Oxidation oder Reduktion des Analyse­moleküls erfolgt, erhöht. Nach einer gewissen Zeit geht die Spannung wieder auf ihren ursprünglichen Wert zurück [8].

Während die Spannung verändert wird, wird der Fluss als Funktion der Zeit aufgezeichnet [14]. Der gemessene Fluss besteht aus zwei Komponenten: dem Ladefluss und dem faradayschen Fluss. Der Ladefluss ist abhängig von den Redoxreaktionen und der Elektrodenbeschichtung; er ist vergleichbar mit dem Laden eines Kondensators. Der faradaysche Fluss versorgt die Oxidations- und Reduktionsprozesse mit elektrischen Ladungen [19]. Meist liegt die Spannung als Rechtecksignal mit zirka 200 mV über und unter dem anodischen und kathodischen Spitzenpotential des jeweiligen Neuro­transmitters [14].

Diese Technik findet Anwendung, um Echtzeitaussagen über die reelle Konzentration eines bestimmten Neurotransmitters im Gehirn zu machen [8]. In Abbildung 24 ist der chronoamperometrische Fluss für die Untersuchung von Dopamin dargestellt. Bei der Vorwärtsbewegung steigt der Strom für die Dopaminoxidation an, während bei der rückläufigen Bewegung der für die Dopaquinonreaktion ansteigt. Am Anfang jeder Spannungsänderung, weist der Fluss einen scharfen Peak auf – der Ladestrom zur Erstellung eines Gleichgewichts an der Elektrodenoberfläche. Dieser schwächt sich danach bis zur Grundlinie ab. Das zeitabhängige Verhalten des Flusses ist abhängig vom Diffusionsprozess, der durch den Abbau von elektronisch aktiven Neurotransmittern auf der Elektrodenoberfläche bestimmt wird.

Die Chronoamperometrie hat den Vorteil, dass der Ladungsfluss proportional zur Konzentration des jeweiligen Neurotransmitters ist. Außerdem gibt es nur geringe Grundrauschstörungen bei dieser Technik. Es bestehen gute zeitliche Auflösungen und es ist möglich, die verschiedenen Neurotransmitter mit dieser Methode zu unterscheiden [14]. Außerdem nimmt der Ladefluss schneller ab, als der faradaysche Fluss, wodurch mit zunehmender Untersuchungszeit der Ladefluss den Faraday-Anteil immer weniger beeinflusst [19].

Diese Art der Amperometrie­ kann zum Beispiel mit einer Multi-Wall-Carbon-Nanotubes-Glaselektrode, die mit einem Nafion/Ni(OH)2-Gemisch beschichtet ist, durchgeführt werden [4].

3.2.3 Differential Pulsed Amperometry (DPA)

Bei der Differential-Pulsed-Amperometry­ (DPA) wird die Spannung nicht konstant gehalten. Diese Methode basiert auf zwei Pulsspannungsstufen (Abb. 25) [22]. Diese Technik hat eine hohe zeitliche Auflösung und eine hohe Sensitivität. Es wird wie bei der Constant Potential Amperometry pro Sekunde eine Messung durchgeführt. Daher wird die Technik auch dafür genutzt, Veränderungen in der extrazellulären Dopaminkonzentration aufzuzeichnen. Die Differential Pulsed Amperometry leitet sich von der Differential Pulse Voltammetry (DPV) ab. Sie besteht aus einer unlimitierten Serie von dualen Spannungsrechteckimpulsen [28, 15].

Pro Sekunde wird ein Vorpuls appliziert, zum Beispiel bei einer Anfangsspannung von -240 mV bis zu einem konstanten Endpotential von 80 mV, die innerhalb von etwa 100 ms abläuft. Der Vorpuls dient dazu, eine auf den eigentlichen Reiz folgende­ Schreckreaktion zu minimieren. Er wird daher zuvor als schwächerer Reiz zugeführt. Während dessen oxidiert das Dopamin an der Arbeitselektrode, zum Bespiel einer Karbonfaserelektrode, die mit einer Rechteckspannung zwischen 0 V und 2,45 V belegt wird.

Der eigentliche Impuls, der nach dem Vorpuls angelegt wird, besteht aus einem Rechteckimpuls mit einer Amplitude von 40 mV und einer Dauer von 40 ms. Der ­dadurch gemessene Oxidationsfluss deckt sich mit dem Oxidationsspitzenfluss, der mit der Differential Pulse Voltammetry aufgezeichnet werden könnte [25]. Eine hohe Sensitivität wird durch eine elektrochemische Behandlung der Elektrodenoberfläche erreicht. Dies korreliert allerdings mit langsameren Elektrodenreaktionen auf die Stimulation. Diese liegt dann etwa bei 15 s bis 30 s. Schnellere Elektrodenreaktionen erfolgen bei unbehandelten Elektroden [23]. Von Vorteil bei der DPA ist die geringe Neigung zum Auftreten von Elektrodenverschmutzungen, da durch die beiden Pulsspannungsstufen ein Pulskreislauf entsteht, der die Elektrode reinigt.

Dopaminerfassung mit DPA

Für die Dopaminerfassung mit DPA wird eine Referenzelektrode (Silber/Silberchlorid), eine Platin-Hilfselektrode (Platindraht) sowie eine behandelte Karbonfaserelektrode als Arbeitselektrode [25, 23] verwendet. Die bipolare Stimulationselektrode wird im Nucleus Accumbens implantiert, um die mesolimbischen dopaminergen Leitungsbahnen zu stimulieren [23]. An die 250 µm lange und 8 µm messende Karbonfaserelektrode wird eine Dreieckswellenform im Bereich von 0 V bis 2,45 V bei einer Frequenz von 70 Hz für je 20 s angelegt. Im Anschluss an einen Dreieckwellenpuls werden zwei aufeinanderfolgende, 5 s haltende Spannungen mit -0,75 V und 1,5 V angelegt. Diese Einstellungen sorgen für gute katalytische Eigenschaften der Karbon­oberfläche und eine damit in Verbindung stehende hohe Sensitivität für Kationen und somit Dopamin. Nachteilig sind lediglich die langsamen Elektrodenreaktionen [25].

Möglich ist auch die elektrische Stimulation aus 200 Rechteckpulsen mit einer Stromstärke von 250 µA für jeweils 0,5 ms. Der Oxidationsstrom wird dann einmal pro Sekunde aufgezeichnet. Das Ruhepotential liegt bei -240 mV, das Endpotential bei 200 mV; die gemessene Pulsdauer beträgt 40 ms, die gemessene Pulsamplitude 50 mV und die des Vorpulses 100 ms. Bei einer Spannung von 200 mV wird Dopamin an dieser Elektrode oxidiert. Bei einer Stimulationsfrequenz von 10 Hz wird eine Dopaminkonzentration von 0,91 ± 0,24 µmol/l freigesetzt, bei 20 Hz eine Konzentration von 2,4 ± 0,7 µmol/l und bei 40 Hz eine Konzentration von 10,5 ± 6,0 µmol/l. Somit wird die Freisetzung des Dopamins durch einen Anstieg der Stimulationsfrequenz gefördert. Die Amplitude der Freisetzung hängt stark von der Lokalisierung der Karbonfaserelektrode im medialen Teil des Nucleus Accumbens ab. In Abbildung 26 ist dieser Zusammenhang erkennbar. Die x-Achse zeigt die jeweiligen Frequenzen, die y-Achse die Dopaminkonzentration.

Abbildung 27 zeigt die Ergebnisse der Dopaminmessung mit DPA unter verschiedenen Bedingungen. Wie bei CPA verhindert Nomifensin die Aufnahme von Dopamin in die Zellen. Daraus folgt eine höhere Dopaminkonzentration im Gewebe nach Nomifensingabe, wie die ersten beiden Kurven ersichtlich machen. Die einzelnen Aufzeichnungen wurden bei einer Spannung von 200 mV aufgenommen, der Spannung, bei der das Dopamin an der Elektrode oxidiert. Liegt die Ascorbinsäurekonzentration in einem Bereich zwischen 0,1 mmol/l und 1 mmol/l und umgibt DOPAC das Dopamin, wird die Dopaminmessung mit dieser Elektrode nicht beeinflusst. Ein Grund dafür ist, dass die verwendete Elektrode 50-mal empfindlicher auf Dopamin reagiert, als auf die anderen beiden Substanzen. Auffallend ist aber, dass die Reaktionszeit, in der die Elektrode auf die Stimulation reagiert, kürzer als die Stimulationszeit ist.

In einem Konzentrationsbereich von 0,5 µmol/l bis 50 µmol/l Dopamin verhält sich der Messwert linear zur Konzentration. Wenn eine zusätzliche Injektion durch Nomifensin erfolgt, wird die Wiederaufnahme gehemmt und die Dopaminfreisetzung erhöht. Durch Hinzufügen von Amphetamin, Haloperidol und Pargylin verstärkt sich die Dopaminfreisetzung, die durch eine elektrische Stimulation mit 20 Hz für 10 s hervorgerufen wird (Abb. 28). Im Gegensatz zu Nomifensin, Pargylin, Amphetamin und Haloperidol reduziert α-Methyl-p-Tyrosin (A-MPT) die Dopaminfreisetzung (Abb. 29) [23].

Serotoninerfassung mit DPA

Veränderungen des Serotoninspiegels können mittels der Differential Pulsed Amperometry erfasst werden. Bei einer Temperatur von 37 °C wird das Serotonin bei einer Spannung von 160 mV oxidiert. Schon bei einer Spannung von 180 mV verschwindet­ das Signal wieder. Durch eine Temperaturveränderung ändert sich auch die Spannung, bei der die Substanzen oxidiert werden. Somit ist diese Messung sehr temperaturempfindlich. DPA ist eine sensitive und selektive Methode, mit guter zeitlicher Auflösung, um die Funktion des Serotonins näher zu studieren. Die Gegenwart von Dopamin und seinem Stoffwechselprodukt DOPAC sowie Ascorbinsäure hat keine Auswirkung auf die Messung. Weiterhin sind damit, wie bei der Dopaminmessung, nahezu Echtzeitmessungen möglich. Leider wird oft nicht nur Serotonin, sondern auch sein Stoffwechselprodukt 5-HIAA miterfasst, wodurch das Messergebnis ab einer Konzentration von 100 nmol/l verfälscht wird. Jedoch steigt das Messergebnis schon bei einer Konzentration von 1 µM bis 10 µM an. Die Elektrode reagiert empfindlicher auf Serotonin als auf 5-HIAA.

Zur Erfassung von Serotonin eignet sich eine Hilfselektrode (Platindraht), eine Silber/Silberchlorid beschichtete Referenzelektrode und eine Arbeitselektrode aus Karbonfasern, zum Beispiel mit einer Länge von 500 µm und einem Durchmesser von 8 µm. Sie wird in den lateralen Hypothalamus implantiert. Die Serotonin-Leitungswege werden mit einer Bipolarelektrode mit einem Durchmesser von 0,1 mm, einer Länge von 0,2 mm und einem Abstand von 0,5 mm stimuliert.

In einem Beispiel (Abb. 30) wurde diese Elektrode in den dorsalen Raphé-Kern implantiert. Durch elektrische Stimulation (Rechteckpuls mit einer Amplitude von 300 µs für je 0,5 s) ergibt eine Anregung (10 s) des Raphé-Kerns einen Anstieg des amperometrischen Signals im lateralen Hypothalamus. Ein Grund dafür ist, dass die Leitungswege des dorsalen Raphé-Kerns im lateralen Hypothalamus enden.

Eine standardmäßige Stimulation (300 µA für 10 s, Wiederholung im Abstand von fünf Minuten bei 25 Hz oder im Abstand von zehn Minuten bei 50 Hz) setzt 46 ± 2,04 nmol/l Serotonin frei. Um Störsignale bei der Stimulation zu vermeiden, kann das Signal getriggert werden. Eine Stimulationsfrequenz von 50 Hz führt zu den höchsten Flusswerten im lateralen Hypothalamus (Abb. 30) [28]. Der Abstand der Stimulation sollte bei 50 Hz zehn Minuten betragen und bei 25 Hz fünf Minuten, da nur dann ein dauerhaft stabiles Signal erhalten wird (Abb. 31).

Je nachdem, wie tief die Elektrode in die verschiedenen Hirnareale eintritt, erhält man unterschiedliche Flussintensitäten. Die maximalen Werte ergeben sich, wenn die Elektrode im lateralen Hypothalamus 5,75 mm bis 6,25 mm von der Hirnoberfläche einer Ratte entfernt ist (Abb. 32).

Zur genaueren Untersuchung von Serotonin eignet sich auch ein Ablauf aus Vorpuls (5 s, 5 V) an der Arbeitselektrode mit anschließendem dreieckförmigem Anodenpotential. Dieses variiert zwischen 2,4 V bei 70 Hz für 20 s und -0,8 V für 5 s und dann 1,5 V für 5 s. Die Taktdauer beträgt 100 ms, die gemessene Pulsdauer 40 ms, die gemessene Pulsamplitude 40 mV mit einer Anfangsspannung von -240 mV und einer Endspannung bei 160 mV; die Oxidationsamplitude wird jede Minute aufgezeichnet. Diese Untersuchung belegt, dass 8-OH-DPAT der Antagonist von Serotonin ist. Dieser reduziert das amperometrische Signal für ungefähr eine Stunde um circa 35 % (Abb. 33).

Im Gegensatz dazu erhöhen 100 mg/kg Pargyline das Signal auf 194 % (Abb. 34), 5 mg/kg d-Norfen-fluramine das Signal auf 243 % (Abb. 35) und 100 mg/kg L-Tryptophan das Signal auf 136 % (Abb. 36) [28]. Die Differential Pulsed Amperometry eignet sich auch zur Noradrenalinerfassung [28].

3.2.4 Triple Pulsed Amperometry (TPA)

Mit der Triple Pulsed Amperometry werden häufig Baseline Noises untersucht, die im Zusammenhang mit der Wellenform und dem Oxidationszyklus an der Elektrode stehen. Unter Baseline Noise wird die kurzzeitigen Veränderungen des Grundniveaus von einer geraden Linie, die durch elektrische Signalschwankungen, Temperaturschwankungen und andere Faktoren hervorgerufen werden, verstanden. Diese haben meist eine höhere Frequenz als diejenigen, die zur Stimulation verwendet werden. Baseline Noise wirken sich negativ auf die Erfassungssensitivität der Messung aus.

Bei der Triple Pulsed Amperometry wird eine sich ändernde Spannung eingesetzt, wie in der schematischen Darstellung von Abbildung 37 gezeigt ist. Bei dieser Technik tritt wieder das Prinzip der selbstreinigenden Elektrode auf. Dieser Effekt wird durch die induzierte Wellenpulsform begünstigt, wodurch die Reproduzierbarkeit von Ergebnissen sowie eine bessere Sensitivität gewährleistet werden.

Aspekte um amperometrische Techniken zu vergleichen sind die elektrochemischen Antworten, die verwendete Wellenform, die Selbstreinigungsfähigkeit sowie die verwendete Spannung in Bezug auf Zeitabstände und Dauer. Dabei lassen sich Vorteile der Differential Pulsed Amperometry und der Triple Pulsed Amperometry gegenüber der konventionellen Constant Potential Amperometrie feststellen in Bezug auf ihre Erfassungssensitivität und ihre Fähigkeit der selbstständige Elektrodenreinigung. Mit DPA kann ein besseres und stabileres Grundniveau erzeugt werden im Vergleich zur Triple Pulsed Amperometry. Diese eignet sich besser zur Untersuchung von komplexen Matrix-Proben [22].

-wird fortgesetzt-

Literatur

[4] Ali Babaei, Ali Reza Taheri: Nafion/Ni(OH)2 nanoparticles-carbon nanotube composite modified glassy carbon electrode as a sensor for simultaneous determination of dopamine and serotonin in the presence of ascorbic acid; (en), Sensors and Actuators B, no. 176, pp. 543–551, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925400512009331, 2013

[5] R. N. Goyal, S. P. Singh: Simultaneous voltammetric determination of dopamine and adenosine using a single walled carbon nanotube – Modified glassy carbon electrode; (en), Carbon, no. 46, pp. 1556–1562, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0008622308003308, 2008

[6] Van Gompel, Jamie J, S.-Y. Chang, S. J. Goerss, I. Y. Kim, C. Kimble, K. E. Bennet, K. H. Lee: Development of intraoperative electrochemical detection: wireless instantaneous neurochemical concentration sensor for deep brain stimulation feedback; Neurosurg Focus, vol. 2, no. 29, pp. E6, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20672923, 2010

[8] K. Jackowska, P. Krysinski: New trends in the electrochemical sensing of dopamine; (en), Anal Bioanal Chem, vol. 11, no. 405, pp. 3753–3771, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/
articles/PMC3608872/, 2013

[9] D. Brondani, J. Dupont, A. Spinelli, I. Cruz Vieira: Development of biosensor based on ionic liquid and corn peroxidase immobilized on chemically crosslinked chitin; (en), Sensors and Actuators B, no. 138, pp. 236–243, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925400508008368, 2009

[13] E. Kätelhön, B. Wolfrum: On-chip redox cycling techniques for electrochemical detection; (en), Reviews in Analytical Chemistry, pp. 7–14, http://www.degruyter.com/view/j/revac.2012.31.issue-1/revac-2011-0031/
revac-2011-0031.xml, 2012

[14] K. T. Kawagoe, J. B. Zimmerman, R. M. Wightman: Principles of voltammetry and microelectrode surface states; (en), Journal of Neuroscience Methods, no. 48, pp. 225–240, http://www.sciencedirect.com/science/
article/pii/0165027093900948#, 1993

[15] E. Dickinson: Modeling Electroanalysis: Cyclic Voltammetry; available: http://www.
comsol.de/blogs/modeling-electroanalysis-cyclic-voltammetry/ (2014, Jul., 28)

[16] D. Patrascua, I. David, V. David, C. Mihailciuc, I. Stamatin, J. Ciurea, L. Nagy, G. Nagy, A. Alexandru Ciucu: Selective voltammetric determination of electroactive neuromodulating species in biological samples using iron(II) phthalocyanine modified multi-wall carbon nanotubes paste electrode; (en), Sensors and Actuators B, no. 156, pp. 731–736, 2011

[18] D. P. Jang, I. Kim, S.-Y. Chang, H.-K. Min, K. Arora, M. P. Marsh, S.-C. Hwang, C. J. Kimble, K. E. Bennet, K. H. Lee: Paired pulse voltammetry for differentiating complex analytes; (en), Analyst, vol. 6, no. 137, pp. 1428–1435, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3349343/, 2012

[19] J. A. Stamford: In vivo voltammetry: Promise and perspective; (en), Brain Research­ Reviews, no. 10, pp. 119–135, http://www.
sciencedirect.com/science/article/pii/0165017385900025, 1985.

[20] A. Molina, E. Laborda, F. Martínez-Ortiz, D. F. Bradley, D. J. Schiffrin, R. G. Compton: Comparison between double pulse and multipulse differential techniques; (en), Journal of Electroanalytical Chemistry, vol. 659, no. 1, pp. 12–24, http://www.sciencedirect.com/
science/article/pii/S1572665711002001, 2011

[21] Do Hyoung Kim, Yoonbae Oh, Hojin Shin, Charles D. Blaha, Kevin E. Bennet, Kendall H. Lee, In Young Kim, Dong Pyo Jang: Investigation of the reduction process of dopamine using paired pulse voltammetry; (en), Journal of Electroanalytical Chemistry, no. 717-718, pp. 157–164, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1572665714000277#, 2014

[22] X. Li, Z. Chen, J. Pan, F. Yang, Y. Li, M. Yao: Differential pulsed amperometry coupled to microchip capillary electrophoresis; (en), J. Chromatogr. A, no. 1291, pp. 174–178, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0021967313005323, 2013

[23] M. F. Suaud-Chagny, P. Brun, M. Buda, F. Gonon: Fast in vivo monitoring of electrically evoked dopamine release by differential pulse amperometry with untreated carbon fibre electrodes; (en), Journal of Neuroscience Methods, vol. 45, no. 3, pp. 183–190, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/016502709290075O, 1992

[24] J. M. Bledsoe, C. J. Kimble, D. P. Covey, C. D. Blaha, F. Agnesi, P. Mohseni, S. Whitlock, D. M. Johnson, A. Horne, K. E. Bennet, K. H. Lee, P. A. Garris: Wireless Instantaneous Neurotransmitter Concentration System – based amperometric detection of dopamine, adenosine, and glutamate for intraoperative neurochemical monitoring; (en), Journal of Neurosurgery, vol. 4, no. 111, pp. 712–723, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2808191/, 2009

[25] M.-F. Suaud-Chagny: In vivo monitoring of dopamine overflow in the central nervous system by amperometric techniques combined with carbon fibre electrodes; (en), Measurement of neuropeptide release and dense core granule fusion, vol. 33, no. 4, pp. 322–329, http://www.sciencedirect.com/science/
article/pii/S1046202304000210, 2004

[26] D. Schönfuß, T. Reum, Ph. Olshausen, T. Fischer, R. Morgenstern: Modelling constant potential amperometry for investigations of dopaminergic neurotransmission kinetics in vivo; (en), Journal of Neuroscience Methods, no. 112, pp. 163–172, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0165027001004654?via=ihub, 2001

27] K. T. Kawagoe, R. M. Wightman: Characterization of amperometry for in vivo measurement of dopamine dynamics in the rat brain; (en), Talanta, vol. 41, no. 6, pp. 865–874, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0039914094E0064X, 1994

[28] L. Terreni, C. Gemma, M. G. de Simoni: Electrically evoked 5-hydroxytryptamine efflux in rat hypothalamus studied using in vivo amperometry; (en), Journal of Neuroscience Methods, vol. 68, no. 1, pp. 71–79, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0165027096000751, 1996

DOI: 10.7395/2016/Rech03

Abbildung 14: Potentialverläufe für die DPV-Varianten [20]

Abb. 15: Differentielle Pulsvoltammetrie bei 25 µmol/l Dopamin bei einem pH-Wert von 7,2 bei folgenden Elektroden: (i) Basal-Plane-Pyrolytic-Graphite-Elektrode; (ii) Edge-Plane-Pyrolytic-Graphite-Elektrode; (iii) aufbereitete SWCNT-modifizierte GC-Elektrode und (iv) unbehandelte SWCNT-modifizierte GC-Elektrode

Abb. 16: Differentielle Pulsvoltammetrie bei verschiedenen Ascorbinsäurekonzentrationen (mol/l): (a) 0; (b) 5,0 x 10-4; (c) 2,5 x 10-3; (d) 4,0 x 10-3; (e) 5,0 x 10-3 unter Verwendung einer Nano-Au/PPyox/GC-Elektrode; Phosphatpuffer mit pH 7,0 und 5,0 x 10-6 mol/l Dopamin und 5,0 x 10-6 mol/l Serotonin; Bildungszeit von 240 s [5]

Abb. 17: Zyklisches Voltammogramm mit verschiedenen Prozentverhältnissen von Nujol und BMIPF6: (I) 100:0, (II) 50:50 und (III) 0:100; die Elektrode enthält Peroxidase und Chitin in einer Phosphatepufferlösung (0,1 mol/l, pH 7,0); die Messlösung enthält 1,1 x 10-4 mol/l Adrenalin und 9,69 x 10-5 mol/l Wasserstoffperoxid; gemessen wurde mit 80 Hz, einer Pulsamplitude von 60 mV und einer Scanrate von 5,0 mV/s [9]

Abb. 18: Üblicher FSCV-Potentialverlauf (oben) und PPV-Potentialverlauf zum Vergleich [18]

Abb. 19: Datenanalyse bei PPV [18]

Abb. 20: PPV-Ergebnisse der Dopaminerfassung mit einem Potentialwechsel von +1,0 V bis +1,5 V (2 ms Lücke) und Umkehrpotentialen von +1,0 V (A) und +1,5 V (B) [21]

Abb. 21: Auswirkungen der Wiederholungszeit bei PPV [18]

Abb. 22: Darstellung der extrazellulären Dopaminkonzentration während elektrischer Stimulation, aufgezeichnet mittels CPA; im medialen Forebrain Bundle mit 4 Pulsen und einer Amplitude von 2 mA über eine Zeitdauer von je 200 µs; A = 20 Hz, B = 100 Hz, Kurve vor einer Nomifensinbehandlung mit 20 mg/kg und danach [26]

Abb. 23: Erfassung von Glutamat durch ein konstantes Potential an einem Platindraht (PT), der mit Nafion und Glutamat-Oxidase (Glu-Ox) beschichtet ist [6]

Tab. 3: Überblick über einige Enzyme-Linked Mikroelektroden, die bei der Fixed-Potential-Amperometry Verwendung finden, um Neurotransmitter zu messen [24]

Abb. 25: Schematische Darstellung der Spannungswellenform der Differential-Pulsed-Amperometry; E0 ist die Grundspannung, von der aus das Spannungsniveau in zwei Schritten (E1 und E2) erniedrigt wird [22]

Abb. 24: Spannungswellenform bei der Chrono­amperometrie (A) und der zugehörige gemessene Fluss (B) während der Aufnahme von Dopamin [14]

Abb. 27: Aufnahme der Dopaminfreisetzung vor und nach einer Nomifensininjektion mittels Differential-Pulse bei einer Spannung von 200 mV (Messung im Sekundentakt); im Abstand von 5 Minuten erfolgt eine elektrische Stimulation mit 20 Hz für jeweils 10 s; Abstand zwischen erster Messung und Nomifensininjektion (10 mg/kg) waren 10 min sowie 15 min. Im Anschluss wurde die Elektrodenreaktion auf Ascorbinsäure und die für DOPAC dargestellt und schließlich der Fluss bei verschiedenen Dopaminkonzentrationen in Gegenwart von Ascorbinsäure und DOPAC [22]

Abb. 26: Messung der Dopaminfreisetzung bei einer elektrischen Stimulation mit 200 Pulsen bei 10 Hz, 20 Hz und 40 Hz für jeweils 20 s sowie einer angelegten Spannung von 200 mV [22]

Abb. 28: Dopaminfreisetzungen in Gegenwart von Nomifensin, Pargylin, Amphetamin und Haloperidol bei Stimulation mit 20 Hz für jeweils 10 s im Abstand von 5 min; die Punkte repräsentieren den Mittelwert mit Fehlerabweichungen [22]

Abb. 29: Dopaminfreisetzung in Gegenwart von Nomifensin α-Methyl-p-Tyrosin bei Stimulation mit 20 Hz für jeweils 10 s, stimuliert im Abstand von 5 min; Mittelwerte mit Fehlerabweichungen [22]

Abb. 30: Elektrische Stimulation des dorsalen Raphé-Kerns und deren Amplitudenmessung im lateralen Hypothalamus mit unterschiedlicher Frequenz (jeweils 10 s im Abstand von 10 min, wobei 50 Hz das beste Ergebnis liefert [22]

Abb. 31: Elektrische Stimulation des dorsalen Raphé-Kerns und deren Amplitudenmessung im lateralen Hypothalamus; ein dauerhaft stabiles Signal erfordert 25 Hz im Abstand von 5 min und erneute Stimulation bei 50 Hz im Abstand von 10 min [22]

Abb. 32: Aufnahme der Serotoninfreisetzung im Hypothalamus einer Ratte; maximales Signal bei einer Eindringtiefe von 5,75 mm bis 6,25 mm und Stimulation mit 50 Hz für jeweils zehn Sekunden sowie Wartezeit von 10 min zwischen Anregungen [22]

Abb. 33: Aufnahme der Serotoninfreisetzung im Hypothalamus nach Hinzufügen von 250 µg/kg 8-OH-DPAT [22]

Abb. 34: Aufnahme der Serotoninfreisetzung im Hypothalamus nach Hinzufügen von 100 mg/kg Paragyline [22]

Abb. 35: Aufnahme der Serotoninfreisetzung im Hypothalamus nach Hinzufügen von 5 mg/kg d-Norfenfluramin [22]

Abb. 36: Aufnahme der Serotoninfreisetzung im Hypothalamus nach Hinzufügen von 100 mg/kg Tryptophan [22]

Abb. 37: Schematische Darstellung der Spannungswellenform der Triple Pulsed Amperometry [22]